معلومة

هل بنيات إدراج الخميرة تعود؟


إذا أدخلت جينًا جديدًا به خميرة تدمج البلازميد واخترتها مرة واحدة مع ثقافة التسرب ، فهل يمكنني أن أفترض أن الجين المدمج حديثًا سيبقى في السلالة دون ممارسة ضغط انتقائي عليه؟ (على سبيل المثال ، هل يمكنني استخدام مزرعة وألواح سائلة عادية بعد الحصول على الخميرة مع السلالة المدمجة حديثًا؟


يعتمد ذلك على ما قمت به بالضبط.

تتمثل الطريقة القياسية لاستخدام بلازميد تكامل الخميرة (YIp) في الاندماج في الجينوم عن طريق إعادة التركيب بين قطعة من DNA الخميرة التي يحملها YIp ونفس الحمض النووي في الجينوم. هذا غالبًا ، ولكن ليس بالضرورة ، العلامة القابلة للتحديد. لذلك على سبيل المثال ، يحمل YIp امتداد URA3 الجين باعتباره الحمض النووي الخميرة الوحيد الخاص به سوف يتكامل في URA3 locus (ربما متحولة للسماح باختيار Ura+، بشكل صحيح أكثر ura3).

إذا كان YIp خطيًا عن طريق القطع في موقع داخل URA3 هذا سيوجه الإدخال وسيزيد من كفاءة التحويل.

بمجرد أن يتم الإدراج ، فإن التكوين في موقع التكامل هو:

كروموسوم ... URA3 ... تسلسلات YIp أخرى ... ura3 ... كروموسوم

هذا غير مستقر بطبيعته لأنه يمكن أن يقع حدث تكرار عبر إعادة التركيب بين URA3 / ura3 المناطق. لذا فإن إزالة التحديد يعني أنك تخاطر بفقدان الملحق. علاوة على ذلك ، من الممكن حدوث التكرار مع ترك ملف URA3 أليل خلف بدلاً من ura3 أليل. لذلك يمكنك أن تفقد المتجه حتى مع الحفاظ على الانتقاء (لكن هذا يعتمد على الطبيعة الدقيقة للطفرة).

يمكن إجراء تكوينات أكثر تعقيدًا حيث يكون تسلسل الاستهداف منفصلاً عن العلامة القابلة للتحديد ، وحيث يزيل الهضم جزءًا كاملاً من تسلسل الاستهداف قبل التحويل. لذلك على سبيل المثال إذا كان TRP1 تم استخدام الجين لاستهداف البلازميد باستخدام URA3 علامة في أ TRP1 ura3 سلالة ستحصل عليها:

كروموسوم ... جزء TRP1 A ... URA3 + متواليات YIp أخرى ... جزء TRP1 B ... كروموسوم

المحول الناتج هو الآن Ura+ بسبب التكامل URA3 البلازميد ، ولكن بعض TRP1 الحمض النووي مفقود الآن (الحمض النووي الذي تم استئصاله عندما تم هضم البلازميد) وبالتالي فإن السلالة موجودة trp1. ظهور هذا TRP- يشير النمط الظاهري إلى أن التحول قد حدث على الأرجح من خلال المسار الموصوف.

في هذه الحالة ، يكون البلازميد المُدرج أكثر استقرارًا نظرًا لأن هذين الجزأين المتبقيين من TRP1 الحمض النووي ليس متطابقًا ، لذلك لا توجد إمكانية للتكرار.

باختصار ، إذا كان المحول الخاص بك يحتوي على ملحق يحمل "الجين الجديد" محاطًا بتسلسل متكرر ، فهذا يعني أنه غير مستقر ، وإلا فلا بأس من إزالة التحديد. في الحالة الأولى ، إذا كان الجين الجديد ضارًا على الإطلاق ، فسيكون هناك ضغط انتقائي قوي لصالح الخلايا التي فقدت الإدخال.

إضافة

يمكنك تجنب استخدام بلازميدات YIp تمامًا عن طريق دمج جينك الجديد في أي مكان باستخدام بادئات مستهدفة طويلة ، كما هو موضح في الشكل أدناه.

صمم مواد أولية لتضخيم الجين الخاص بك كالمعتاد ، ولكن قم بتوليفها بامتدادات 40 نقطة أساس 5 بوصة تقابل تسلسلين في الأطراف القصوى من موقع التكامل (URA3 المستخدمة هنا لأغراض التوضيح). يمكن بعد ذلك استخدام الجزء الناتج في تحويل وسيتم دمجه في URA3 الموقع عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، لتحل محل الحمض النووي المقيم. ميزة استخدام ملفات URA3 لهذا يمكنك اختيار الأعداد الصحيحة مثل Ura- الخلايا بمقاومة حمض الفلوروتيك (FOA). على الرغم من أنه يمكنك الاختيار مباشرة لهذا ، فقد قمت دائمًا بتحويل الجزء مع بلازميد آخر قابل للتحديد (LEU2, TRP1 إلخ ، ولكن ليس بلازميد CEN) ثم على سبيل المثال ، ليو+ يمكن فحص المحولات لتلك التي أصبحت أيضًا FOAص. يحدث هذا التحول المشترك بتردد عالٍ جدًا لأن الخلايا التي تأخذ الحمض النووي تأخذ الكثير منه. بمجرد إزالة التحديد الخاص بالبلازميد المحول المشترك ، فسوف يضيع قريبًا ، مما يترك لك عددًا صحيحًا نظيفًا غير مرتد.

لقد مرت فترة منذ أن فعلت هذا النوع من الأشياء - ربما توجد طرق أكثر ذكاءً الآن.


من المعروف أن بلازميدات تكامل الخميرة مستقرة ، حتى في حالة عدم وجود وسيط انتقائي ، ولكنها يمكن أن تعود مثل معظم بلازميدات إعادة التركيب المتجانسة.

نقلا عن الكتاب تحليل جينات الخميرة (ص 476):

YIps بشكل عام أكثر استقرارًا من YRp أو YEp plasmids. نتيجة لذلك ، من الآمن زراعة معظم السلالات الحاملة لـ YIp في الوسائط الغنية ، على الرغم من أنه من الممارسات الجيدة تخزينها في ظل ظروف انتقائية. يعتمد استقرار السلالات الحاملة لـ YIp على طبيعة حدث التكامل. على سبيل المثال ، إذا كان YIp يولد تكرارًا مترادفًا عند الاندماج في الجينوم ، فيمكن أن يعود هذا إلى النوع البري عن طريق حدث إعادة التركيب المتماثل داخل الجزيء.

-> ومن ثم استخدام العلامات بانتظام وبشكل متكرر.

مصادر:

ميك إف تويتي ، تحليل جين الخميرة ، المجلد 26 (المطبعة الأكاديمية ، 1998) ص 476


A الخميرة ABC التفاعلية التمهيدي

يوفر تحليل تفاعل ناقل الكاسيت المرتبط بالخميرة ATP نظرة ثاقبة ذات صلة بصحة الإنسان حول تنظيم ووظيفة عائلة البروتين التي تحدد تحمل الظروف الفسيولوجية والإجهاد المفروض خارجيًا.

استخدمت معظم الدراسات الخاصة بتفاعل بروتين الخميرة إما نظام الخميرة ثنائي الهجين (YTH) لتحديد وصلات الطعم والفريسة القابلة للذوبان داخل النواة أو MS لتحديد مكونات المجمعات المشتركة القابلة للذوبان الموسومة بعلامات التقارب (AP-MS). بالنسبة لبروتينات الغشاء ، تم استخدام MS من المجمعات المشتركة المستقرة ، المنقاة بتقارب ، والمنظفات القابلة للذوبان في المنظفات 8. تكتشف جميع المناهج الثلاثة التفاعلات الوظيفية والتنظيمية التي يمكن شرحها من خلال "الشعور بالذنب بالارتباط". ومع ذلك ، توجد قيود مهمة في الحصول على نتائج عالية الجودة على مستوى النظام ويعتمد تحديد الشبكات ذات الخصائص الطوبولوجية والبيولوجية المختلفة على الطريقة 9. يستخدم نظام الخميرة الغشائية ثنائي الهجين (MYTH) إعادة تشكيل يوبيكويتين منقسم للإبلاغ عن التفاعلات بين بروتينات الغشاء المقدمة كطُعم وفرائسها فى الموقع 10. يتم التحقق من إعادة تكوين اليوبيكويتين شبه الأصلي الذي ينشط الجينات التي تسمح بالنمو على وسط انتقائي باستخدام مراسل lacZ ، بينما يتم تأكيد توطين الطعم المتوقع باستخدام YFP المرفق بالطعم (iMYTH) 3،10. سنايدر وآخرون. استخدم تحليل النمط الظاهري لتقييم تأثير بنيات الطعم الناقل ABC للخميرة المختارة على وظيفة الخلية ومجال ubiquitin C الطافر الذي يتطلب مجمع طعم فريسة لإعادة تكوين اليوبيكويتين. يؤكد تكميل الفلورسنت ثنائي الجزيء باستخدام YFP المنقسم تفاعلات الطعم والفريسة ويحدد التوطين الخلوي للمجمع المشترك للطعم الفريسة.


المقدمة

يتم التوسط في نقل البروتينات عبر وتكامل غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER) بواسطة مجمع النقل Sec61 (جونسون وفان وايس ، 1999). تستهدف البروتينات هذا المركب عن طريق تسلسل إشارات كارهة للماء (von Heijne ، 1990). يتم دمج الإشارات غير المشقوقة والأجزاء الكارهة للماء من البولي ببتيد في الطبقة الثنائية مثل حلزونات الغشاء. لم يتم فهم محددات طوبولوجيا البروتين في الغشاء ولا آلية التكامل بشكل كامل. أبسط حالة لتكوين البروتين في الغشاء هي اتجاه تسلسل الإشارة عند دخول الترانكونون. قد تنقل تسلسلات الإشارة إما نهاية الطرف C (إشارات قابلة للكسر ومثبتات الإشارة) أو نهاية الطرف N (مراسي الإشارة العكسية). أفضل محدد محدد لتوجيه الإشارة هو توزيع المخلفات المشحونة على جانبي النواة الكارهة للماء للإشارة. وفقًا "لقاعدة الداخل الإيجابي" (von Heijne، 1986 Hartmann وآخرون. ، 1989) ، فإن النهاية الأكثر إيجابية هي بشكل عام عصاري خلوي. المحددات الإضافية هي طي التتابعات N- الطرفية إلى إشارة داخلية قد تعيق بشكل معقّم نقل N (Denzer وآخرون. ، 1995) ، والكراهية للماء من نواة إشارة القطبية (ساكاغوتشي وآخرون.، 1992 Wahlberg and Spiess، 1997 Eusebio وآخرون. ، 1998 هارلي وآخرون. ، 1998 روش وآخرون. ، 2000 Goder and Spiess ، 2003).

يتكون Sec61 translocon من Sec61α (Sec61p في الخميرة) مع 10 نطاقات عبر الغشاء ، والبروتينات المفردة الممتدة Sec61β (Sbh1p) و Sec61γ (Sss1p) ، المقابلة في البكتيريا إلى مجمع SecY (SecY / SecG / SecE). التركيب البلوري الحديث لمجمع SecY البكتيري البدائي لـ Methanococcus jannaschii (فان دن بيرج وآخرون. ، 2004) عن حزمة حلزونية مضغوطة بشكل مدهش مع مسام قناة محبة للماء وموقع خروج جانبي مصنوع من مقاطع الغشاء TM2 و TM7 ، بما يتوافق مع بيانات الربط المتقاطع السابقة (Plath). وآخرون. ، 1998). يقترح أن قناة النقل يتم تشكيلها بواسطة مغاير مغاير واحد. يمثل الهيكل بوضوح الحالة المغلقة ، لأن الممر المركزي يتم حظره بواسطة مجال قابس لومن وحلقة انقباض مركزية. للفتح ، يجب أن يتحرك القابس للخارج ويجب أن تتوسع الحلقة لتوسيع الممر المركزي. من خلال طفرات السيستين والربط المتبادل لثنائي كبريتيد ، تم إثبات أن نقل البولي ببتيدات ينتقل بالفعل إلى مركز SecY في الإشريكية القولونية (مدفع وآخرون، 2005). من المحتمل أن يكون مجال القابس متورطًا في بوابة الترانكون الذي يتم تشغيله بواسطة تسلسل الإشارة للسماح بدخول ونقل البولي ببتيد المراد نقله ولإغلاق القناة عند الخمول (تام وآخرون., 2005).

في تحليل منهجي للمخلفات المشحونة المحفوظة في Sec61p والتي كانت مرشحة لتكون مسؤولة عن قاعدة الداخل الإيجابي ، تم تحديد ثلاث بقايا ، R67 و R74 و E382 ، للوفاء بمعايير زيادة نقل N لمرساة إشارة نموذج بروتين مع رسوم مرافقة أكثر إيجابية من N-terminal عند تحور وتقليل إزاحة N لبروتين نموذجي بفرق شحنة معاكسة (Goder وآخرون، 2004). استنادًا إلى بنية مجمع SecY للبكتيريا الأثرية ، يقع E382 في الطرف السيتوبلازمي للجزء عبر الغشاء TM8 ، وكلاهما R67 و R74 في مجال التوصيل ، ويبدو أن المواضع مناسبة للتأثير على اتجاه إشارة تدخل القناة المغلقة. لاختبار دور مجال المكونات في اتجاه الإشارة وأهميته لوظيفة translocon وصلاحية الخلية ، تم إدخال طفرات محددة لتعكير صفو هيكلها ، بما في ذلك الحذف الكامل. من المثير للدهشة أن الطفرة أو الحذف في مجال المكونات لم يؤثر على قابلية البقاء أو النمو ، على الرغم من انخفاض كفاءة النقل وتشكيل transocon.


المواد والأساليب

البناء البلازميد

تم بناء البلازميد pUC21ΔBB عن طريق شق pUC21 (11) مع باممرحبا و BglII متبوعًا بربط لحذف الجزء الموجود بين الموقعين ، لا يحتوي البلازميد الناتج على a باممرحبا ولا أ Bglموقع التقييد الثاني. تم إنشاء Plasmid pUC21-NotI عن طريق إدخال 123 نقطة أساس لاأنا جزء متعدد الوصلات من pFA6b البلازميد (12) إلى pUC21ΔBB الذي تم قطعه باستخدام لاتم استخدام إستراتيجية مماثلة لإنشاء نواقل مكافئة باستخدام علامة مقاومة كانامايسين ، pUK21ΔBB و pUK21-NotI ، بدءًا من البلازميد pUK21 (11).

بلازميد ح-بولي-ح شيدت في عدة خطوات. جزء 912 نقطة أساس (ح-L) مع تسلسل من ح المروج (–2720 إلى –1814 المنبع من ATG) بواسطة PCR مع بادئات مصممة لتوليد جزء باستخدام هينDIII و بي إس آيتسلسلات WI المتراكمة (انظر أدناه). تم إدخال هذا الجزء في هينDIII-بي إس آيهضم WI pUC21-NotI. جزء A 507 BP (ح-R) مع تسلسل من 3 ′ نهاية ح تم تصنيع الجين (+1199 إلى +1699 المصب من ATG) بواسطة PCR باستخدام بادئات مصممة لتوليد جزء باستخدام سابقة بمعنى البيئةRI و SFIأنا متسلسلة متراكمة (انظر أدناه). تم إدخال هذا الجزء في سابقة بمعنى البيئةRI-SFIلقد هضمت pUC21-NotI. بلازميد ح-بولي-كان MX4-ح تم إنشاؤه عن طريق إدخال 1494 نقطة أساس بي إس آيWI-سابقة بمعنى البيئةجزء RI مع KanMX4 من البلازميد pFA6-KanMX4 (12) إلى بي إس آيWI-سابقة بمعنى البيئةهضمها RI ح-بولي-ح. بلازميد ح-hisG-URA3-hisG-بولي-ح تم إنشاؤه عن طريق إدخال 3853 نقطة أساس بامأهلا-Bglالجزء الثاني مع hisG-URA3-hisG كاسيت (8) في باممرحبا هضمها ح-بولي-ح.

تضخيم PCR لـ حتم إجراء -L باستخدام طريقة "استنساخ PCR ذات النهاية اللاصقة" (13) باستخدام أربعة بادئات ، F852 – F855 (الجدول 1). باختصار ، تتضمن هذه الطريقة إجراء تفاعلين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) متبوعين بانصهار وتليين الحمض النووي. ينتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل مع البادئات F852 و F854 جزء غير حاد حيث يحتوي كل طرف على 5 نقاط أساس من أي من هينDIII أو بي إس آيمواقع التعرف على WI. في تفاعل منفصل ، ينتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل مع البادئات F853 و F855 جزء غير حاد حيث يحتوي كل طرف على 1 نقطة أساس مطلوبة هينDIII أو بي إس آيمواقع التعرف على WI. يتم خلط تفاعلين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ويتم صهرهما عند 100 درجة مئوية ، ثم يتم تبريدهما ببطء للسماح بتلدين الحمض النووي. ينتج عن التلدين من الحمض النووي أربعة أنواع من منتجات الحمض النووي بنهايات مختلفة. ربع نواتج الحمض النووي لها بروزات ناتجة عن الاستنساخ في الناقل المهضوم هينDIII و بي إس آيWI. تقضي هذه الطريقة على الخطوة الإشكالية في بعض الأحيان المتمثلة في تقييد هضم منتجات الحمض النووي بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم استخدام نفس الطريقة لإعداد حجزء -R باستخدام الاشعال F856 – F859.


النتائج

يقوم Sla1p بترجمة بقع الأكتين القشرية

تم حذف SLA1 يتسبب في أن تكون الخلايا حساسة لدرجة الحرارة للنمو وأن يكون لها عيوب أكتين مرتبطة بها تتميز ببقع قشرية أقل وأكبر (هولتزمان وآخرون.، 1993). للتأكد مما إذا كانت تأثيرات الطفرات في SLA1على تنظيم الأكتين قد يكون مباشرًا ، تم تحديد التوطين الخلوي لـ Sla1p. جينات أخرى ، مثل ANC1، التي تشفر بروتينًا نوويًا ، تسبب عيوبًا في الأكتين عند حذفها ، على الرغم من أن منتجاتها الجينية لا تتمركز في الهيكل الخلوي الأكتين (ويلش ودروبين ، 1994). تم رفع المصل المضاد إلى الأحماض الأمينية 854-920 من Sla1p. بعد تنقية التقارب ، تعرف هذا المصل المضاد على بروتين واحد قدره 148 كيلو دالتون (مقابل وزن جزيئي متوقع يبلغ 136 كيلو دالتون) على البقع الغربية (الشكل 1 أ). يوضح الشكل 1 ، B و C ، تلازم Sla1p مع مجموعة فرعية من بقع الأكتين القشرية. لم يلاحظ توحيد موقع Sla1 في كبلات الأكتين. بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن هناك تلطيخ يمكن اكتشافه فيsla1 خلايا فارغة (نتائجنا غير المنشورة). لقد أنشأنا أيضًا نسخة ذات علامة myc من Sla1p ، والتي كشفت عن نمط تلطيخ مثل ذلك الذي تم الحصول عليه باستخدام الأجسام المضادة لـ Sla1p (نتائجنا غير المنشورة). توضح بيانات التألق أن Sla1p في وضع جيد للعب دور مباشر في تنظيم تجميع الأكتين في قشرة خلية الخميرة.

التين. 1. توطين Sla1p والأكتين باستخدام الفحص المجهري المناعي غير المباشر مزدوج التسمية. (أ) تم استخدام الأجسام المضادة التي تم رفعها إلى Sla1p لاكتشاف Sla1p على البقع الغربية للخلايا من النوع البري ولإثبات نقص البروتينات التفاعلية في sla1 خلايا فارغة. (B و C) تم إجراء الفحص المجهري المناعي بعد ذلك لتوطين Sla1p (C) والأكتين (B) في خلايا ثنائية الصبغيات من النوع البري. بار ، 5 ميكرومتر.

توطين البروتينات المرتبطة بالأكتين في غياب Sla1p

تظهر العديد من البروتينات تلامسًا كاملًا أو جزئيًا مع بقع الأكتين القشرية. لا تتشابه البروتينات الأخرى مثل Rab-GTPase Sec4p مع الأكتين ولكنها مع ذلك تعتمد على هيكل خلوي أكتين سليم لتحقيق توطين مستقطب في موقع البرعم المفترض وفي برعم الخلايا النامية. لاستكشاف الدور المحتمل لـ Sla1p في توطين هذه البروتينات ، تم توطين 11 بروتينًا مرتبطًا بالقشرة جنبًا إلى جنب مع الأكتين في النوع البري وsla1 خلايا فارغة. من بين البروتينات التي تم اختبارها والمعروف أنها ترتبط بالأكتين أو التي تظهر ارتباطًا وثيقًا مع الأكتين ، استمر معظمها في القيام بذلك حتى عندما فقد الأكتين هيكله "الرقعي" من النوع البري في sla1 خلايا فارغة. تضمنت هذه الفئة Abp1p و Sac6p و cofilin و Srv2p و Arp2p و Las17p / Bee1p (Drubin وآخرون.، 1988 قمر وآخرون.، 1993 فريمان وآخرون.، 1996 مورو وآخرون.، 1996 Li، 1997) ، كما هو موضح في الشكل 2 ، A و B ، لـ Abp1p. بالإضافة إلى ذلك ، هناك ثلاثة بروتينات (Cdc42p و calodulin و Spa2p) شديدة الاستقطاب في الخلايا ولكنها لا تتجمع مع الأكتين (Snyder، 1989 Brockerhoff and Davis، 1992 Ziman وآخرون.، 1993) مترجمة بشكل طبيعي في غياب Sla1p (نتائجنا غير المنشورة). في المقابل ، أظهر بروتينان آخران تغييرات كبيرة في توطينهما في sla1 خلايا فارغة. Sla2p ، التي تحتوي على منطقة C-terminal مع تماثل مع Talin (Holtzman وآخرون.، 1993 Raths وآخرون.، 1993) ويربط الأكتين في المختبر (McCann and Craig ، 1997) ، والذي يُظهر تمازجًا كبيرًا مع بقع الأكتين القشرية في الجسم الحي (يانغ ، كوب ، ودروبين ، ملاحظات غير منشورة) ، لا يتحد مع الأكتين في غياب Sla1p. بدلاً من الارتباط بقطع الأكتين sla1 خلايا فارغة ، تم العثور على Sla2p في بقع صغيرة في محيط الخلية (الشكل 2 و C و D). بالإضافة إلى ذلك ، فإن Sla2p ليس مستقطبًا جيدًا في غياب Sla1p كما هو الحال في الخلايا البرية. تم تقييم تغلغل النمط الظاهري لعدم تمركز رقعة الأكتين Sla2p / القشرية القشرية من خلال عد 100 خلية في كل تجربة من التجارب الثلاثة. في الخلايا البرية من النوع ، أظهرت بقع Sla2p تمركزًا مع مجموعة فرعية من بقع الأكتين في 88 ٪ من الخلايا التي تم حسابها. ومع ذلك ، في الخلايا التي لم يتم التعبير عن Sla1p فيها ، أظهر 24 ٪ فقط من الخلايا تمركز بقع Sla2p مع هياكل الأكتين القشرية. وتجدر الإشارة ، مع ذلك ، إلى أن الالتقام الخلوي ، الذي يتطلب Sla2p (Raths وآخرون.، 1993) بشدة في Δsla1 الخلايا (Ayscough ، ملاحظة غير منشورة).

التين. 2. توطين البروتينات في غياب Sla1p.sla1 نمت الخلايا الفارغة لتسجيل الطور وفحصها بواسطة الفحص المجهري المناعي مزدوج التسمية. (أ و ب) الخلايا المسمى Abp1p (A) و actin (B). (C و D) ملطخة الخلايا لـ Sla2p (C) والأكتين (D). بار ، 5 ميكرومتر.

البروتين الثاني الذي وجد أنه يتمركز بشكل شاذ في غياب Sla1p هو Rho1p. تم رفع الأجسام المضادة وتنقيتها من التقارب ضد ببتيد Rho1p (انظر المواد والطرق) للتعرف على بروتين بالحجم المناسب بواسطة النشاف الغربي ، وقد أدى احتضان الأجسام المضادة مع الببتيد إلى منع هذا الاعتراف (الشكل 3 أ). بالإضافة إلى ذلك ، زادت شدة هذا النطاق عندما RHO1 تم التعبير عنه بشكل مفرط (الشكل 3 ب). عندما تم استخدام الأجسام المضادة في التمركز المناعي في الخلايا البرية ، تم العثور على Rho1p في رقعة في الموقع حيث سيحدث ظهور البراعم ، عند طرف البرعم الجديد ، ثم حول قشرة البرعم أثناء نموه (الشكل 3C ) ، كما هو موضح سابقًا (Yamochi وآخرون.، 1994). في غياب Sla1p ، على الرغم من أن توطين Rho1p كان طبيعيًا نسبيًا أثناء تكوين البرعم ، أظهرت العديد من الخلايا غير المرصوفة تلطيخًا في جميع أنحاء قشرة الخلية (الشكل 3D). في المقابل ، في الخلايا البرية ، كان القليل من التلطيخ القشري العام واضحًا في الخلايا غير المرحة (الشكل 3 ج). أظهرت التهم أن ما يقرب من 50 ٪ من غير مرطب sla1أظهرت الخلايا الفارغة تلطيخًا قشريًا غير مناسب (الشكل 3E).

الشكل 3. حذف SLA1 يؤثر على توطين Rho1p. (A و B) اللطخات المناعية لمحللات الخلية الكاملة (10 ميكروغرام / ممر) تم فحصها باستخدام الأجسام المضادة المضادة لـ Rho1p المنقاة من التقارب. (أ) محلول من الخلايا البرية (DDY664) يتم فحصه بأجسام مضادة غير معالجة (الممر الأيسر) أو بنفس الأجسام المضادة بعد الحضانة المسبقة مع مستضد الببتيد Rho1p (الممر الأيمن). (ب) محللات DDY1097 (تحمل أفتاهRHO1 تم تحضير الممر الأيمن للبلازميد) و DDY1098 (يحمل بلازميد تحكم) بعد النمو على الجالاكتوز لمدة 8 ساعات وتم فحصه باستخدام الأجسام المضادة لـ Rho1p (أسفل) أو (كعنصر تحكم في التحميل) باستخدام الأجسام المضادة لـ β-tubulin (أعلى). (C و D) تمركز مناعي لـ Rho1p في خلايا مرحلة السجل من النوع البري (C) و sla1 خلايا فارغة (D) بار ، 5 ميكرومتر. (ه) تم حساب أنماط تلطيخ الخلايا غير المرحة. البيانات الموضحة هي متوسطات ثلاث تجارب تم فيها تسجيل 200 خلية على الأقل غير مزدحمة. يُفترض أن البقعة المفردة للتلوين في الخلايا البرية غير المبشورة هي الموقع الذي سيخرج منه البرعم الجديد.

أظهرنا سابقًا أنه في وجود عقار latrunculin-A المعطل للأكتين ، كان Sla1p قادرًا على التوطين في قشرة الخلية ولكنه لم يكن قادرًا على الاستقطاب إلى موقع البرعم الأولي (Ayscough وآخرون.، 1997). النتيجة المعروضة هنا والتي تُظهر اعتماد Rho1p على Sla1p لتوطينها من شأنها أن تشير إلى أن Rho1p يجب أن يكون أيضًا غير قادر على الاستقطاب في حالة عدم وجود هيكل خلوي أكتين سليم. اختبرنا اعتماد توطين Rho1p على F-actin كما هو موضح في Ayscough وآخرون. (1997) ولاحظ أن Rho1p كان قادرًا على التوطين في قشرة الخلية في وجود latrunculin-A ولكنه لم يكن مستقطبًا في نهايات الخلية (نتائجنا غير المنشورة). أظهر عدد الخلايا أن & gt70٪ من الخلايا أظهرت تلطيخًا قشريًا ولكن غير مستقطب لـ Rho1p وأظهر 13٪ تلطيخًا على كل من القشرة بأكملها وفي رقعة في أحد طرفي الخلية. لم تظهر الخلايا المتبقية أي تلطيخ يمكن اكتشافه لـ Rho1p.

ينظم Rho1p الإنزيم المركب لجدار الخلية 1،3-β-glucan synthase (Drgonová وآخرون.، 1996 قدوتا وآخرون.، 1996). للتحقق مما إذا كان التوطين غير الطبيعي لـ Rho1p في sla1 الخلايا الفارغة أثرت على ترسب جدار الخلية ، استخدمنا المجهر الإلكتروني. كما هو مبين في الشكل 4 ، فإن ملف sla1 أظهرت الخلايا الطافرة الصفرية سماكة شاذة لجدران الخلايا الأم والخلايا غير الملتفة. يبدو أن هذا التكاثف متجانس على السطح الكامل للخلايا غير المكسوة والخلايا الأم ولكنه لم يمتد إلى البراعم (الشكل 4 ب) ، بما يتوافق مع التوطين الطبيعي نسبيًا لـ Rho1p في الخلايا الناشئة (انظر أعلاه).

الشكل 4. تحتوي الخلايا الخالية في sla1 على جدران خلوية سميكة. (أ) من النوع البري و (ب) Δsla1 نمت الخلايا لتسجيل الطور ثم تم تثبيتها ومعالجتها من أجل الفحص المجهري الإلكتروني باستخدام تثبيت برمنجنات البوتاسيوم لتعزيز تصور جدار الخلية والأغشية.

يحدد التعبير عن الأشكال المتحولة لـ Sla1p المجالات الوظيفية داخل البروتين

يشير التسلسل الأساسي لـ Sla1p إلى وجود عناصر هيكلية داخل البروتين يمكن أن تكون مسؤولة عن وظائف وتفاعلات محددة. سلسلة من sla1 تم التعبير عن طفرات الحذف (الشكل 5) بتنسيقsla1 خلايا فارغة لاستكشاف هذا الاحتمال. تحققت اللطخات الغربية من أنه تم التعبير عن مستويات مماثلة من Sla1p في الخلايا التي تحمل التركيبات المختلفة (نتائجنا غير المنشورة) ، مما يشير إلى أن ثبات بروتينات Sla1 الطافرة لم تنخفض بشكل ملحوظ.

التين. 5. متحولة sla1 يبني. ترد تفاصيل بناء البلازميد في الجدول 2.

حددنا بعد ذلك ما إذا كانت بروتينات Sla1 المتحولة قادرة على إنقاذ نمطين ظاهريين مرتبطين بحذف SLA1والنمو الحساس لدرجة الحرارة والاعتماد على Abp1p. تم طلاء المحولات على وسائط انتقائية مناسبة عند 25 درجة أو 37 درجة مئوية (الشكل 6 أ). تمكنت جميع التركيبات باستثناء واحدة ، Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 ، من إنقاذ حساسية درجة حرارة sla1 متحولة فارغة. افتقر هذا البناء إلى المنطقة بين مجالات SH3 الثانية والثالثة (Gap1) وكذلك مجال SH3 الثالث (الشكل 5). ومن المثير للاهتمام ، أن المسوخات التي تفتقر إلى Gap1 وحده أو مجال SH3 الثالث وحده كانت قادرة على دعم النمو في درجة حرارة nonpermissive. بالإضافة إلى ذلك ، دعم بناء آخر ، Sla1-ΔG2 ، النمو الضعيف فقط عند 37 درجة مئوية.

التين. 6. نمو الخلايا التي تحتوي على بروتينات Sla1 الطافرة. (أ) الخلايا التي تكون فيها النسخة الجينومية SLA1 تم حذف (KAY14) مع امتداد sla1 بنيات متحولة ومطلية على وسط انتقائي عند 25 درجة و 37 درجة مئوية. (ب) خلايا تحمل ABP1 على URA3تم تحويل البلازميد ذو العلامات المميزة (KAY78) باستخدام sla1 بنى متحولة واختبارها للنمو على وسط انتقائي في وجود أو عدم وجود 5-FOA. (ج) تم تحويل الخلايا (KAY14) مع sla1بنى متحولة Sla1-C-term.rpts و Sla1ΔGap1 + SH3 # 3 واختبارها للنمو عند 37 درجة مئوية. تم التحقق من التعبير عن كلا الشكلين من Sla1p بواسطة النشاف الغربي.

تم اختبار انقاذ النمط الظاهري للاعتماد Abp1p عن طريق الطلاءsla1 abp1 الخلايا ثنائية الطافرة التي تحمل aURA3-ملحوظ ABP1 وأعرب عن البلازميد المختلفة sla1 mutant على وسيط يحتوي على 5-FOA ، والذي يختار مقابل ABP1- تحمل البلازميد (الشكل 6 ب). في هذه الخلايا ، ABP1 كان حاضرًا فقط فيURA3بلازميد مميز. في حالة عدم وجود Sla1p ، لا يمكن لهذه الخلايا أن تنمو بدون ABP1 البلازميد ونتيجة لذلك لا يمكن أن تنمو على لوحات 5-FOA. من بين الأشكال المتحولة لـ Sla1p ، فشلت الخلايا التي تعبر عن تكرار Sla1-C-terminal فقط في إنقاذ اعتماد Abp1p. تشير هذه النتيجة إلى أن منطقة التكرار هذه متورطة في وظيفة زائدة عن الحاجة مع وظيفة Abp1p.

في هذا التحليل الأولي ، حددنا بروتينًا متحورًا واحدًا أنقذ اعتماد Abp1p على sla1 null mutant ولكن ليس حساسيته لدرجة الحرارة والثانية أنقذت حساسية درجة الحرارة ولكن ليس الاعتماد على Abp1p. لاختبار ما إذا كان يمكن إجراء وظيفتي Sla1p في المحولات ، تم تحويل البنائين المتحولين إلى sla1 خلايا فارغة. نمت المحولات بشكل سيء للغاية عند 37 درجة مئوية (الشكل 6C) ، مما يشير إلى أن Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 يمنع بشكل تنافسي تكرار Sla1-ΔC-terminal (Sla1-C-term.rpts).

منظمة الأكتين في الخلايا التي تعبر عن الأشكال الطافرة لـ Sla1p

كما ذكر أعلاه، sla1 تحتوي المسوخات الفارغة على عدد أقل من بقع الأكتين القشرية ، وتظهر هذه البقع أكبر وأقل استقطابًا من المعتاد (الشكل 7 و B و C). لتقييم ما إذا كان يمكن أن يُعزى هذا النمط الظاهري للأكتين الشاذ إلى مجال معين من Sla1p ، قمنا بتلوين الخلايا التي تعبر عن طفرات Sla1p المختلفة باستخدام Rd-phalloidin. تم حساب الخلايا التي تحتوي على بقع أكتين من النوع البري أو الشاذة القشرية ، ويتلخص هذا في الشكل 7 أ. تم توضيح الخلايا التمثيلية لثلاثة من المسوخ في الشكل 7 ، D-F. كان للخلايا التي تعبر عن Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 (الشكل 7 د) أشد نمط ظاهري أكتين ، مشابه لذلك الموجود في sla1الخلايا الفارغة ، مما يشير إلى أن هذا المجال يلعب دورًا مهمًا في تنظيم تنظيم الأكتين القشري. في المقابل ، كان للخلايا التي تعبر عن معظم الأشكال الطافرة الأخرى لـ Sla1p نمط تلطيخ لا يمكن تمييزه تقريبًا عن تلك الموجودة في الخلايا البرية. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 7E نمط التلوين لتكرار المحطة Sla1-ΔC. وبالتالي ، تحتوي هذه البروتينات على المعلومات اللازمة للحفاظ على التنظيم الطبيعي للهيكل الخلوي الأكتين القشري. بعض الطفرات ، بما في ذلك Sla1-ΔSH3 # 1 & amp2 و Sla1-ΔGap1 ، لها نمط ظاهري أكتين مخترق جزئيًا مع 15-20٪ من الخلايا في المجموعة السكانية التي تحتوي على قطع أكتين ، على الرغم من أن الخلايا المتبقية لها مظهر أكتين من النوع البري (الشكل 7F و Sla1-ΔSH3 # 1 و amp2).

التين. 7. تنظيم الأكتين في الخلايا التي تعبر عن أشكال متحولة من Sla1p. تمت معالجة خلايا الطور اللوغاريتمي لتلطيخ Rd-phalloidin. (أ) لكل متحولة تم تسجيل 300 خلية على الأقل لتشكل رقعة الأكتين من النوع البري أو الشاذ. يتم عرض الصور التمثيلية لتلطيخ الأكتين للخلايا التي تعبر عن (B) من النوع البري Sla1p ، (C) لا Sla1p ، (D) Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 ، (E) Sla1-ΔC-terminal يكرر ، (F) Sla1- ΔSH3 # 1 & amp2. بار ، 5 ميكرومتر.

لقد أجرينا أيضًا الفحص المجهري مزدوج التألق المناعي للأكتين و Sla2p في الخلايا التي تعبر عن أشكال متحولة من Sla1p (نتائجنا غير المنشورة). أشارت نتائجنا إلى أن فك اقتران Sla2p وتوطين رقعة الأكتين القشري يرتبط بشدة عيب الأكتين بدلاً من مجال ربط Sla2p محدد في Sla1p.

تحليل دور Sla1p باستخدام فحص خلية Permeabilized

تم استخدام اختبار خلية نفاذية في المختبر لاختبار دور Sla1p في تنظيم تجميع رقعة الأكتين. يقيس الاختبار التجمع المنوي لأكتين رودامين مضاف خارجيًا في بقع مستقطبة في قشرة الخلايا المنفذة (Li وآخرون.، 1995). تشبه هذه البقع تلك التي لوحظت في الجسم الحي من حيث حجمها وتوزيعها (الشكل 8 أ). كما ورد سابقًا (Liوآخرون.، 1995) ، permeabilized sla1 الخلايا الفارغة غير قادرة على دعم تجميع الأكتين المنوي وعرض مستوى خلفية منخفض فقط من مضان رودامين - أكتين الذي لا يتم تجميعه أبدًا في بقع قشرية (الشكل 8 ب). sla1 خلايا فارغة تعبر عن ثلاثة من المتحولة sla1 تم فحص التركيبات ، وتم قياس البيانات والتعبير عنها كمجموعة من شدة التألق المقاسة داخل براعم الخلايا الصغيرة. الخلايا التي تعبر عن Sla1-ΔSH3 # 1 & amp2 أو Sla1-C-terminal تتكرر بتجميع بقع مستقطبة مميزة من رودامين أكتين تشبه تلك التي شوهدت في الخلايا من النوع البري ، وكانت مستويات التألق مشابهة لـ ، أو (لـ Sla1-ΔSH3 # 1 & amp2) إلى حد ما أكبر من تلك التي لوحظت في الخلايا البرية (الأشكال 8 و C و E).

التين. 8. دمج رودامين-أكتين في الخلايا المنحلة معبرة عن الأشكال الطافرة لـ Sla1p. الخلايا التي تعبر عن (A) من النوع البري Sla1p ، (B) no Sla1p ، (C) Sla1-ΔSH3 # 1 & amp2 ، (D) Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 ، (E) Sla1-C-term. تمت زراعة التكرارات ، وتم تفريغها ، واختبارها لتجميع الأكتين كما وصفها Liوآخرون.، (1995) (انظر المواد والطرق). ثم تم عرض مواقع التأسيس بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، وتم قياس شدة التألق في البراعم. وحدات شدة التألق عشوائية. بار ، 5 ميكرومتر.

في المقابل ، تسبب حذف منطقة Gap1 ومجال SH3 الثالث معًا ، ولكن ليس بمفردهما ، في أن تكون الخلايا معيبة تمامًا في دمج رودامين أكتين في هياكل الأكتين القشرية (الشكل 8 د).

لمزيد من التحقيق في أهمية Sla1p في تجميع بقع الأكتين ، تمت إضافة مستخلصات الخلايا مرة أخرى إلى النفاذة. sla1الخلايا الفارغة في محاولة لإعادة تكوين نشاط تجميع الأكتين. يمكن بالفعل استعادة النشاط عن طريق إضافة مقتطفات من الخلايا البرية ، ولكن مقتطفات من sla1 لم تكن الخلايا الفارغة أو من الخلايا التي تعبر عن Sla1-ΔG1 + SH3 # 3 فقط قادرة على استعادة نشاط تجميع الأكتين (Eby و Ayscough ، البيانات غير المنشورة انظر المواد والطرق). تقدم هذه البيانات مزيدًا من الدعم للاستنتاج القائل بأن Sla1p يلعب دورًا مباشرًا في تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين القشري.

يمكن لمتماثل الخميرة الانشطارية لـ SLA1 إنقاذ حساسية درجة الحرارة لخلايا S. cerevisiae sla1 الفارغة

متماثل كامل من SLA1 تم التعرف عليه فيS. بومبي قاعدة بيانات الجينوم. على الرغم من أن تشابه التسلسل الإجمالي ليس مرتفعًا (27 ٪) ، إلا أن المتوقع S. بومبييحتوي البروتين على نفس المجالات التي يمكن التعرف عليها من Sla1p ، بما في ذلك ثلاثة مجالات SH3 ، ومخطط حلزون البرولين ، ومنطقة تكرار C- الطرفية (الشكل 9 أ). بالإضافة إلى ذلك ، في الثلث المركزي من البروتينات كانت منطقتان غير مرتبطتين ، كل منهما 60 من الأحماض الأمينية ، والتي كانت أكثر تشابهًا (هوية 58 و 60 ٪ ، على التوالي) من أي جزء آخر من البروتين (الشكل 9 أ). لا تشترك هذه المجالات في التماثل الكبير مع التسلسلات الأخرى في قواعد البيانات المتاحة للجمهور. تم رفع أمداد الأمصال إلى S. cerevisiae لم يتعرف Sla1p على بروتين بالحجم المناسب على لطخة غربية من S. بومبي البروتينات ، كما أنها لم تعط نمط تلطيخ مميز عن طريق التألق المناعي. ال S. pombe sla1 تم استنساخ الجين من DNA cosmid إلى ناقل فرط التعبير وتحويله إلى S. cerevisiae الخلايا التيSLA1 تم حذفه. ال S. بومبي كان الجين قادرًا على الإنقاذ جزئيًا لحساسية درجة الحرارة المرتبطة بالحذف (الشكل 9 و B و C) ، ومع ذلك ، فإن تلطيخ هذه الخلايا للأكتين يشير إلى أن تنظيم الأكتين الشاذ لم يتم إنقاذه بواسطة جين الخميرة الانشطارية.

الشكل 9. إن S. بومبي تجانسSLA1 ينقذ حساسية درجة الحرارة S. cerevisiae sla1Δ خلايا. (أ) S. بومبي يحتوي Sla1p على بنية مجال مشابهة لتلك الخاصة بـ S. cerevisiaeSla1p. تم تحديد منطقتين من تناسق عالٍ SHD (مجال التماثل Sla1p) 1 و 2. يتم ملاحظة النسب المئوية لهوية نطاقات SH3 ومناطق SHD أسفل الأشكال المعنية. نموS. cerevisiae sla1 خلايا فارغة (KAY14) تحتوي علىS. cerevisiae SLA1, S. pombe sla1، أو الناقل وحده عند (ب) 29 درجة مئوية و (37 درجة مئوية).


حالات قليلة القسيمات البديلة لمركب الخميرة Rvb1 / Rvb2 الناجم عن علامات الهيستيدين

Rvb1 و Rvb2 ضروريان AAA + (أTPases أssociated الخلوية المتنوعة أctivities) الهليكازات ، وهي مكونات مهمة للمجمعات الحرجة مثل إعادة تشكيل الكروماتين ومجمعات التيلوميراز. كانت حالة قلة القسيمات لبروتينات Rvb مثيرة للجدل. Independent studies from several groups have described the yeast and human Rvb1/Rvb2 complex both as a single and as a double hexameric ring complex. We found that histidine-tagged constructs of yeast Rvb proteins employed in some of these studies induced the assembly of double hexameric ring Rvb1/Rvb2 complexes. Instead, untagged versions of these proteins assemble into single hexameric rings. Furthermore, purified endogenous untagged Rvb1/Rvb2 complexes from خميرة الخميرة were also found as single hexameric rings, similar to the complexes assembled في المختبر from the purified untagged components. These results demonstrate that some of the differences between the reported structures are caused by histidine tags and imply that further studies on the purified proteins should be carried out using untagged constructs.


Yeast are first cells known to cure themselves of prions

When colonies of baker's yeast cells that contain clumped prion proteins (colonies of white cells on left) are stressed by high temperatures, some can convert the aggregated prion proteins to the non-clumping form of the protein (red cells in the colonies the right). Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

Yeast cells can sometimes reverse the protein misfolding and clumping associated with diseases such as Alzheimer's, according to new research from the University of Arizona.

The new finding contradicts the idea that once prion proteins have changed into the shape that aggregates, the change is irreversible.

"It's believed that when these aggregates arise that cells cannot get rid of them," said Tricia Serio, UA professor and head of the department of molecular and cellular biology. "We've shown that's not the case. Cells can clear themselves of these aggregates."

Prions are proteins that change into a shape that triggers their neighbors to change, also. In that new form, the proteins cluster. The aggregates, called amyloids, are associated with diseases including Alzheimer's, Huntington's and Parkinson's.

"The prion protein is kind of like Dr. Jekyll and Mr. Hyde," said Serio, senior author of the paper published today in the open-access journal eLife. "When you get Hyde, all the prion protein that gets made after that is folded in that bad way."

For yeast, having clumps of amyloid is not fatal. Serio and her students exposed amyloid-containing cells of baker's yeast to 104 F (40 C), a temperature that would be a high fever in a human. When exposed to that environment, the cells activated a stress response that changed the clumping proteins back to the no-clumping shape.

The finding suggests artificially inducing stress responses may one day help develop treatments for diseases associated with misfolded prion proteins, Serio said.

"People are trying to develop therapeutics that will artificially induce stress responses," she said. "Our work serves as a proof of principal that it's a fruitful path to follow."

First author on the paper "Spatial quality control bypasses cell-based limitations on proteostasis to promote prion curing" is Serio's former graduate student Courtney Klaips, now at the Max Planck Institute for Biochemistry in Munich. The other authors are Serio's students Megan Hochstrasser, now at the University of California, Berkeley, and Christine Langlois of Brown University.

National Institute of Health grants R01 GM069802001, F31 AG034754 and F31 GM099383 funded the research.

These yeast cells contain a prion protein that can change shape from a non-clumping form to one that aggregates into clumps called amyloids. Proteins in these cells have the non-clumping shape and are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

To accomplish their jobs inside cells, proteins must fold into specific shapes. Cells have quality-control mechanisms that usually keep proteins from misfolding. However, under some environmental stresses, those mechanisms break down and proteins do misfold, sometimes forming amyloids.

Cells respond to environmental stress by making specific proteins, known as heat-shock proteins, which are known to help prevent protein misfolding.

Serio and her students wanted to know whether particular heat-shock proteins could make amyloids revert to the normal shape. To that end, the team studied yeast cells that seemed unable to clear themselves of the amyloid form of the prion protein Sup35.

The researchers were testing one heat-shock protein at a time in an attempt to figure out which particular proteins were needed to clear the amyloids. However, the results weren't making sense, she said.

So she and Klaips decided to stress yeast cells by exposing them to a range of elevated temperatures - as much as 104 F (40 C) - and let the cells do what comes naturally.

As a result, the cells made a battery of heat-shock proteins. The researchers found at one specific stage of the cell's reproductive cycle, the yeast could turn aggregates of Sup35 back into the non-clumping form of the protein.

Yeast cells reproduce by budding. The mother cell partitions off a bit of itself into a much smaller daughter cell, which separates and then grows up.

The researchers found in the heat-stressed yeast, just when the daughter was being formed, the mother cell retained most of the heat-shock proteins called chaperones, especially Hsp-104. As a result, the mother had a particularly high concentration of Hsp-104 because little of the protein was shared with the daughter.

The fluorescent green chunks in these yeast cells are prion proteins that have assumed the shape that aggregates into clumps called amyloids. The prion proteins in these cells are tagged with a marker that fluoresces green under UV light. Credit: Serio laboratory/ UA molecular and cellular biology

The mother cells ended up "curing" themselves of the Sup35 amyloid, although the daughters did not. The degree of curing was correlated with the concentration of Hsp-104 in the cell, and the higher the temperature the more Hsp-104 the cells had.

The Hsp-104 takes the protein in the amyloid and refolds it, Serio said. But she and her colleagues found that just inducing high levels of Hsp-104 in cells by itself does not change the amyloid protein back to the non-clumping form.

"Clearly the heat-shock proteins are collaborating in some way that we don't understand," she said.

Having the amyloid-forming version of the protein is not automatically bad, she said. It may be that shape is good under some environmental conditions, whereas the non-aggregating form is good under others.

Even in humans, amyloid forms of a protein can be helpful, she said. Amyloid proteins are associated with skin pigmentation and with hormone storage.

To clear the amyloid from yeast cells, these experiments triggered cells to make many different heat-shock proteins.

Serio now wants to figure out the minimal system necessary to clear amyloids from a cell. Knowing that may help the development of drug therapies for amyloid-related human diseases, she said.


شكر وتقدير

This work was supported by the European Commission (Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network “HONOURS” grant agreement no. 721367), the Swiss National Science Foundation (SNF grants CRSII3_160780 and 310030_173085), the German Research Council (DFG grants SFB-TR84 (TRR 84/3, A07) and DR 772/7-2), the Federal Ministry of Education and Research (BMBF grant RAPID, 01KI1723A) and by core funds of the University of Bern. We thank S. Vashee for the provision of the TAR vectors and for discussions related to his herpesvirus work J. Peters Zocher for her advice in generating the figures F. Suter-Riniker and P. Bittel for providing clinical samples staff from the Next Generation Sequencing platform (University of Bern) and M. Schweizer, P. Plattet, M. Gerber, M. Friesland, M. Alves, N. Vielle, B. Zumkehr, M. Brügger and D. Brechbühl for reagents, technical advice and helpful discussions. This study is dedicated to S. Kunz.


نتائج ومناقشة

Efficient Construction of Yeast Homozygous Diploid Strains

Our strategy for construction of homozygous diploid cells is shown in Figure 1B . As a host strain, we used either a حصيرة أ أو حصيرة & # x003b1 haploid strain carrying i) PSTE18-URA3, which expresses the URA3 gene under the control of haploid specific STE18 (G-protein γ subunit) promoter [11] and ii) PGAL1-HO, which expresses the HO endonuclease under the control of GAL1 promoter (repressed by glucose and induced by galactose [12]). Once the host strain is transiently incubated on galactose plates (ح induction) , the mating-type switch (حصيرة أحصيرة & # x003b1 أو حصيرة & # x003b1حصيرة أ) occurs and consequently diploid cells are formed by mating of حصيرة أ و حصيرة & # x003b1 cells within colonies. Following short induction times of ح (㰒 hours), the colonies contain three cell types, حصيرة أ, حصيرة & # x003b1، و حصيرة أ / & # x003b1. Our strategy can select diploids by counter selection using 5-FOA, where haploids cannot grow because Ura3 (orotidine-5′-phosphate decarboxylase) converts 5-FOA into a toxic compound [13], while diploids are resistant to 5-FOA because URA3 is not expressed. Leaky expression of ح does not matter as long as the host strain is maintained on plates lacking uracil.

First, we investigated whether the PSTE18-URA3 gene allows selecting for diploid cells. We constructed wild-type PSTE18-URA3 و hog1Δ PSTE18-URA3 strains in the three cell types (حصيرة أ, حصيرة & # x003b1، و حصيرة أ / & # x003b1) and grew them on SC plates lacking uracil or containing 0.1% 5-FOA. As shown in Figure 2A , the haploid and diploid PSTE18-URA3 strains showed the expected phenotypes, i.e. the haploid strains were uracil prototrophic and 5-FOA sensitive, and the diploid strains were uracil auxotrophic and 5-FOA resistant. Moreover, the haploid cells that germinated from spore progeny of the diploid PSTE18-URA3 strains displayed uracil prototrophy and 5-FOA sensitivity ( Figure 2B ). Taken together, these results demonstrate that the PSTE18-URA3 gene can be used as a diploid selection marker.

(A) The haploid and diploid PSTE18-URA3 strains display opposite growth phenotypes on plates lacking uracil or containing 5-FOA. The strains were grown for 2𠄳 days at 30ଌ. (B) The growth phenotype of the diploid PSTE18-URA3 strain can revert to that of haploid after sporulation. The indicated diploid strains were sporulated, tetrads were dissected and spore progeny was grown on YPD plate for 3 days at 30ଌ. Then, the cells were replicated on the indicated plates and grown for 2𠄳 days at 30ଌ.

Next, we determined the efficiency of construction of diploids by our strategy. The wild-type PSTE18-URA3 و hog1Δ PSTE18-URA3 سلالات (حصيرة أ و حصيرة & # x003b1) carrying pJH283 (PGAL1-HO) were grown overnight on galactose plate, and then cells were restreaked on SC plate containing 0.1% 5-FOA. The single colonies obtained on the 5-FOA plate were analyzed by two methods: i) observation of pseudohyphal growth on SLAD plate, and ii) determination of mating type by PCR. All of the single colonies analyzed (10 colonies for each strain) showed diploid specific patterns: i) strongly enhanced pseudohyphal growth (data not shown), and ii) two PCR bands corresponding to diploids (Figure S1). These results indicate that our method is highly efficient for construction of diploid strains.

Screening Suppressor Mutations of Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

To demonstrate that our strategy for construction of diploid strains is useful for genetic studies of diploid-specific developments, we applied it to yeast filamentous growth in the � background. Transposon insertion mediated-random mutagenesis and -systematic gene disruption have previously been employed to dissect the genetic bases of filamentous growth [14], [15]. However, these studies used haploid strain backgrounds in which filamentous growth was ectopically induced by an extra copy of the opposite mating-type locus and the PHD1 gene (transcriptional activator for filamentation) or by adding 1% butanol to the growth medium. In addition, however, homozygous diploid strains must be used to analyze the genetics of filamentous growth. We have recently reported that hyperosmotic stress inhibits all of the yeast morphological developments and that the Hog1 MAPK is a central negative regulator of these developments [10]. Moreover, the effect of HOG1 deletion is reflected in diploids more clearly than in haploids [16]. Therefore, suppressor mutations of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ are expected to lead to the identification of genes involved in controlling those phenotypes. In the present study, we screened suppressor mutations of complex colony morphology, strong invasive growth, and hyper-filamentous growth in the � hog1Δ/hog1Δ background by constructing homozygous double mutants (i.e. xxx::mTn/xxx::mTn hog1Δ/hog1Δ).

Following the strategy shown in Figure 3A , a transposon insertion mutagenesis was performed using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO) as a host strain. Since the diploid hog1Δ/hog1Δ strain displays complex colony morphology even on YPD plates while the diploid wild-type strain does not [10], [16], mutant strains defective in formation of complex colony morphology were first screened by visual inspection ( Figure 3B ). From more than six thousand 5-FOA resistant strains (candidates for homozygous diploids) which were obtained at 93% success rate of randomly picked transformants, we isolated more than 100 mutant strains that showed smooth- or less complex-colony morphology. The diploid state in those was confirmed by PCR analysis of the mating-type locus. We amplified the transposon insertion regions of these strains by vectorette PCR and sequencing of the PCR products identified 49 unique genes ( Table 1 and Table S1). Morphological developments (complex colony morphology, invasive growth, and filamentous growth) of all 49 homozygous double mutant strains on YPD plates were characterized, and the results are discussed below.

(A) Strategy for screening the suppressor mutations. Using the haploid hog1Δ PSTE18-URA3 strain carrying pJH283 (PGAL1-HO::TRP1) as a host strain, transposon insertion mutagenesis was performed and mutant strains defective in complex colony morphology were screened by visual inspection. The details are described in Materials and Methods. (B) One example of the screening results is shown. The candidates, smooth colony or less complex colony, were further analyzed: identification of the transposon insertion position, mating-type PCR, and morphological assay for invasive growth and filamentous growth.

الجدول 1

الجينCCMIGFGDescription of gene productالمرجعي
ADE6– –– –& # x02013Formylglycinamidine-ribonucleotide (FGAM)-synthetaseهذه الدراسة
AMN1– –& # x02013& # x02013Protein required for daughter cell separation, multiple mitotic checkpoints, and chromosome stability [15]
ATO2– –– –& # x0002bPutative transmembrane protein involved in export of ammoniaهذه الدراسة
CLN1– –& # x02013– –G1 cyclin involved in regulation of the cell cycle [16], [23]
DHH1– –– –& # x02013Cytoplasmic DExD/H-box helicase [24]
FLO8– –– –– –Transcription factor required for flocculation, diploid filamentous growth, and haploid invasive growth [15], [20]
GCN2– –& # x02013& # x0002bProtein kinase that phosphorylates the alpha-subunit of translation initiation factor eIF2 [19]
HIR2– –& # x02013& # x02013Subunit of the HIR complex [15]
HIR3– –& # x02013& # x02013Subunit of the HIR complexهذه الدراسة
IES1& # x02013& # x0002b& # x02013Subunit of the INO80 chromatin remodeling complexهذه الدراسة
IMP2′& # x02013& # x02013& # x02013Transcriptional activator involved in maintenance of ion homeostasis and protection against DNA damageهذه الدراسة
KRE11& # x02013& # x02013& # x0002bSubunit of the TRAPP II (transport protein particle) complexهذه الدراسة
KSS1– –– –– –Mitogen-activated protein kinase involved in filamentous growth and pheromone response [21]
MSN1& # x02013– –& # x02013Transcriptional activator involved in invertase expression and invasive growth/pseudohyphal differentiation [15], [26]
MTC5– –– –– –Subunit of the SEA (Seh1-associated) complexهذه الدراسة
RAD1– –– –& # x02013Single-stranded DNA endonucleaseهذه الدراسة
RAD24& # x02013& # x02013& # x0002bCheckpoint protein involved in the activation of the DNA damage and meiotic pachytene checkpointsهذه الدراسة
RAS2– –– –– –GTP-binding protein that regulates the nitrogen starvation response, sporulation, and filamentous growth [15], [16]
RDI1& # x02013& # x0002b& # x02013Rho GDP dissociation inhibitor involved in the localization and regulation of Cdc42 [22]
RIM9– –– –– –Protein of unknown function involved in the proteolytic activation of Rim101p in response to alkaline pH [15], [27]
SHE10– –& # x02013& # x0002bPutative glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein of unknown functionهذه الدراسة
SIR3– –– –& # x02013Silencing protein that interacts with Sir2p and Sir4p, and histone H3 and H4 tailsهذه الدراسة
SLP1& # x02013& # x02013& # x02013Member of the SUN-like family of proteinsهذه الدراسة
SPT2& # x02013– –& # x02013Protein involved in negative regulation of transcriptionهذه الدراسة
STE7– –– –– –MAPK kinase involved in pheromone response and pseudohyphal/invasive growth [16], [21]
TCO89& # x02013& # x02013& # x02013Subunit of TORC1, a complex that regulates growth in response to nutrient availabilityهذه الدراسة
TEC1– –– –– –Transcription factor required for haploid invasive and diploid pseudohyphal growth (TEA/ATTS family) [14], [15], [16]
UBP6& # x02013& # x02013& # x02013Ubiquitin-specific proteaseهذه الدراسة
YDR306C– –– –& # x0002bF-box protein of unknown functionهذه الدراسة
YHR177W– –– –– –Putative protein of unknown functionهذه الدراسة

Mitochondrial Function Is Essential for Complex Colony Morphology

Sixteen of the 49 strains displayed petite and smooth colony morphology (Figure S2) and were unable to grow on plates containing glycerol as a sole carbon source (data not shown). These phenotypes suggest impaired respiratory growth, and all of these mutations are indeed linked to mitochondrial functions (Table S1). We confirmed that a rho 0 mutant (lacking mitochondria DNA) in the hog1Δ/hog1Δ background also displays petite and smooth colony morphology (Figure S2). Moreover, we identified three additional genes encoding proteins related to mitochondrial functions, ILM1, SCO1، و SDH1 (Table S1). These results indicate that mitochondrial function is essential for complex colony morphology. Jin et al. have previously shown that mitochondrial dysfunction inhibits filamentous growth through the retrograde signaling pathway, which is a mitochondria-to-nucleus pathway transducing changes in mitochondrial function to specific adaptive changes in nuclear gene expression [15]. ILM1 is known to be required for both mitochondrial function and slowed DNA synthesis-induced filamentous growth [17]. However, all of the mitochondria-related mutants identified by our screen poorly suppressed hyper-filamentous growth and strong invasive growth of the hog1Δ/hog1Δ strain (data not shown), suggesting that the hyper-filamentous phenotype of HOG1 deletion involves multiple mechanisms that are not simply suppressed by mitochondrial dysfunction. Alonso-Monge et al. have recently reported that the Candida albicans hog1 mutant shows an enhanced basal respiratory rate compared to the wild-type strain and suggested a link between Hog1 and mitochondrial function [18]. Therefore, it would be interesting to investigate whether and how Hog1 activated by hyperosmotic stress inhibits mitochondrial function during filamentous growth.

Multiple Mechanisms Are Necessary for the Enhanced Morphological Developments of hog1Δ/hog1Δ

In addition to the mitochondria-related mutations, we identified 30 mutations that suppress at least two of the enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ (Table S1) and representative mutants are shown in Figure 4 . Thirteen of the 30 genes have previously been reported to be involved in at least one of the three morphological developments in the S. cerevisiae � background [14], [15], [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24]. Those genes include the well-known STE7, KSS1, TEC1, RAS2، و FLO8 that regulate filamentous growth via the MAPK or cAMP-PKA signaling pathway. These two signaling pathways converge on the regulation of the MUC1 (المعروف أيضًا باسم FLO11) gene [25], which encodes a GPI-anchored cell surface mucin required for morphological developments. DHH1 is involved in translational regulation of the Ste12 transcription factor which is regulated under the Kss1 MAPK pathway and essential for MUC1 expression [24]. GCN2 (general amino acid control system) and MSN1 (transcriptional activator) are involved in the regulation of MUC1 under certain nutrient conditions [19], [26]. Presumably, RIM9 is also important for the regulation of MUC1 through the pH-responsive Dfg16-Rim101 pathway [27]. Thus, our screen implies that impaired MUC1 expression is sufficient to suppress enhanced morphological developments of hog1Δ/hog1Δ. Indeed, deletion of the MUC1 gene in the hog1Δ/hog1Δ background lost the enhanced morphological developments and resulted in morphology similar to a muc1Δ/muc1Δ strain ( Figure 4 ).

CCM: complex colony morphology, IG: invasive growth, FG: filamentous growth. All other suppressor mutants identified are shown in Table 1 .

Seventeen of the 30 mutations occurred in genes not previously implicated in filamentous growth in S. cerevisiae. These gene products are involved in various cellular mechanisms, especially DNA damage checkpoint control (IMP2′, RAD1، و RAD24), gene expression via chromatin remodeling or histone-nucleosome assembly (HIR2, HIR3, IES1, SIR3، و SPT2), control of cell cycle or cell division (AMN1 و YHR177W), and other functions. Although the present study did not reveal the morphological suppressing mechanism by deletion of these genes or physical interactions between Hog1 and the identified targets, our screen could highlight the genetic networks that are required for the enhanced morphological developments independent of the filamentous growth signaling pathways. Since the active Hog1 (Hog1-D170A/F318S) strain inhibits all of the morphological developments in a hyperosmotic stress-independent manner [10], the mechanisms identified in our screen might be negatively regulated by Hog1. While crosstalk between the HOG and filamentous growth MAPK pathways is well established [28], the present mutant collection will enable further analyses of connections between the HOG pathway and other mechanisms. Such efforts can contribute to understanding mechanisms of filamentous growth common between model yeasts and pathogenic yeasts as well as devising novel antifungal targets.

In conclusion, we demonstrate that combinatorial use of the PGAL1-HO و PSTE18-URA3 genes is effective for construction of homozygous diploid strains and a useful tool when combined with large-scale screening. Genetic information of S. cerevisiae homozygous diploids obtained by the method proposed in this study may be useful for the studies of other organisms such as diploid المبيضات البيض in which construction of homozygous mutant strains is a difficult task.


More Information

Applications

Get results fast!

With the Matchmaker Gold system, one-hybrid library screening is straightforward, quick, and easy:

الخطوة 1: Create a bait construct by cloning 1&ndash3 tandem repeats of the target DNA-binding sequence into pAbAi.

الخطوة 2: Create a bait-specific reporter strain by transforming and integrating the linearized pBait-AbAi construct into the Y1H Gold yeast strain and selecting on SD/&ndashUra agar medium.

الخطوه 3: Confirm the integration of the bait sequence using colony PCR and the Matchmaker Insert Check PCR Mix 1.

الخطوة 4: Use SMART technology to synthesize cDNA containing ends that are homologous to the ends of the linearized pGADT7-Rec vector.

الخطوة الخامسة: Create and screen your library in a single step by cotransforming your bait-specific reporter strain with the SMART-generated cDNA and the linearized pGADT7-Rec vector, and plating on AbA-containing selective medium.

الخطوة 6: Harvest the resulting colonies, which contain putative DNA-binding prey proteins, and analyze your library inserts using the Matchmaker Insert Check PCR Mix 2.

Analysis by colony PCR

Screening positive colonies by PCR is a fast and convenient way to analyze the bait strain and sort through the positive clones identified in Y1H and Y2H screens. With the Matchmaker Insert Check PCR Mix 1, you can verify the integration of your Y1H pBait-AbAi construct, and with the companion Matchmaker Insert Check PCR Mix 2, you can quickly sort through and analyze the inserts in positive clones that have emerged from either one-hybrid or two-hybrid screens.

Yeast one-hybrid media

Our yeast one-hybrid media sets each contain a complete set of all the yeast media pouches you need for Matchmaker Gold One-Hybrid protocols.

Additional product information

Please see the product's Certificate of Analysis for information about storage conditions, product components, and technical specifications. Please see the Kit Components List to determine kit components. Certificates of Analysis and Kit Components Lists are located under the Documents tab.

Takara Bio USA، Inc.
الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

Takara Bio Europe عضو في Takara Bio Group ، وهي شركة رائدة في علوم الحياة ملتزمة بتحسين حالة الإنسان من خلال التكنولوجيا الحيوية. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


شاهد الفيديو: الخميرة - الخميرة الفورية - الخميرة الصناعية - الخميرة الكيميائية (كانون الثاني 2022).